Живые часы

Сколендером с сотрудниками. В нем используется поплавковый респирометр, в котором объем пузырька газа поддерживается постоянным.

Чтобы понять принцип действия такого респирометра, вспомним игрушку «ныряльщик». Она была придумана Рене Декартом в XVII веке и основана на том принципе, что каждый плавающий предмет вытесняет количество воды, равное его весу. Ныряльщик представляет собой стеклянную трубочку с небольшим пузырьком газа у запаянного конца. Трубочка ровно настолько заполнена водой, чтобы ныряльщик мог свободно плавать в сосуде с водой. Отверстие сосуда затянуто резиновой пленкой. Когда палец касается пленки, воздух в пузырьке сжимается, внутрь ныряльщика попадает несколько большее количество воды и он тонет. Если палец убрать, воздух снова расширяется и ныряльщик всплывает.

С помощью изящного усовершенствования Суини приспособила поплавковый респирометр для измерения объема кислорода, выделяемого одной-единственной клеткой Gonyaulax.

Вместо стеклянного ныряльщика Суини использовала тончайший капилляр, сделанный из пластика. Один конец капилляра запаивался, другой оставался открытым; в просвете капилляра сохранялось некоторое количество воздуха. При нормальном давлении пластиковый поплавок лежал на дне пробирки с культуральной жидкостью.

Рис. 47. Поплавковый респирометр для измерения выделения кислорода одиночной клеткой Gonyaulax. Вверху слева — полная схема аппарата, показывающая регулировку давления, измерительную систему, бинокулярный микроскоп, направленный на трубку, содержащую поплавок и одиночную клетку Вверху справа — тонкая стеклянная трубка (диаметром 0,1 мм) с культуральной средой, поплавком и одиночной клеткой (при большом увеличении). Внизу — заключенный в капилляре воздух при снижении давления расширяется и, образуя пузырек, поднимает поплавок.

Если давление над раствором понижалось, воздух, находящийся в капилляре, расширялся, образуя на конце поплавка крошечный пузырек. При дальнейшем снижении давления размер пузырька увеличивался и поплавок медленно всплывал. Регулируя давление газа над поверхностью культуральной жидкости, можно удерживать поплавок на определенной высоте.

Теперь уже определить объем кислорода, выделяемого одиночной клеткой, не представляло особого труда. В небольшую пробирку вместе с поплавком помещалась одна клетка Gonyaulax. Выделяемый клеткой кислород увеличивал давление над раствором, сжимал пузырек воздуха, выступающий из поплавка, и поплавок тонул. Снижая давление с помощью дополнительной регулирующей системы, Суини могла компенсировать увеличение давления кислорода и удерживать поплавок на исходной высоте. Таким образом, по изменению давления, которое определялось ртутным манометром, Суини измеряла количество кислорода, выделенного клеткой Gonyaulax.

О сложности этого эксперимента говорит следующее. Суини, регулируя давление в сосуде, должна была удерживать поплавок точно на уровне линии, отмеченной в окуляре микроскопа, через который она вела свои наблюдения. А поскольку при изменении температуры все газы либо расширяются, либо сжимаются, пробирка с клеткой и поплавком помещалась в сосуд с водой, температура которой поддерживалась на постоянном уровне (с точностью до 0,03 °C).

Располагая микрореспирометром и отработав методику, Суини уже могла приступить к изучению интересующего ее вопроса — сохраняют ли одиночные клетки те же ритмы, которые свойственны популяции в целом.

С этой целью клетки Gonyaulax выращивались в условиях чередования 12 часов света и 12 часов темноты. Суини предполагала, что фотосинтетическая активность одиночной клетки будет увеличиваться сразу после рассвета, доходить до некоторого максимума к полудню и снижаться по мере наступления сумерек. Эксперименты полностью подтвердили ее предположения. Но в ходе экспериментов исследовательница столкнулась с неожиданным осложнением — ни в одной из клеток фотосинтез не продолжался более 14 часов. Суини пыталась продлить жизнь клетки, добавляя антибиотики, но это не помогло.

И чтобы охватить измерениями весь 24-часовой период, Суини начинала опыты в разное время суток: на рассвете, через час после рассвета, через два часа после рассвета и так далее, всякий раз наблюдая за клеткой на протяжении 14 часов.

Данные фотосинтетической активности отдельных клеток, полученные в последовательных экспериментах, откладывались на графике, и выводилась суммарная кривая. Она отражала типичный суточный ритм фотосинтетической активности одиночной клетки Gonyaulax, в существовании которого Суини не сомневалась. На рассвете клетка выделяла около двух миллионных долей миллилитра кислорода в час. Через 5 часов это количество увеличивалось почти вдвое, через 14 часов оно снижалось опять до исходного. После достижения этого минимального уровня оно вновь начинало подниматься. Таким образом, эксперимент подтвердил правильную суточную периодичность фотосинтеза у одиночных клеток Gonyaulax.

Теперь можно было переходить к основному эксперименту. Суини вырастила при постоянном ярком освещении новую культуру клеток. И, поместив одиночные клетки из этой культуры в респирометр, вернулась к своим наблюдениям за уровнем поплавка.

Как будет теперь изменяться фотосинтетическая активность? Утратят ли одиночные клетки свой ритм? Будут ли случайные изменения во многих отдельных ритмах взаимно уничтожать, гасить друг друга, так что суммарный эффект популяции не покажет никакой ритмичности.

Огромное количество наблюдений, выполненных Суини, убедительно показало, что клетки в условиях непрерывного освещения ярким светом полностью утрачивают свой ритм. Никакого периодического изменения количества выделенного кислорода не обнаружилось: на рассвете оно составило две миллионных миллилитра в час, как и у клеток, содержавшихся в режиме чередования света и темноты, и больше не увеличивалось, а оставалось на этом уровне в течение 16 и более часов.

Так был получен ответ на первый вопрос Суини. Популяция клеток Gonyaulax polyedra, содержащаяся в условиях непрерывного освещения ярким светом, теряет ритм фотосинтеза, и это исчезновение видимых ритмов отражает не потерю синхронности, а потерю ритма каждой клеткой в отдельности.

15. Таинственные регуляторы времени

Фрэнк А. Браун, профессор биологии Северо-западного университета, занимает позицию, диаметрально противоположную позиции большинства ученых, изучающих биологические ритмы.

После получения степени доктора зоологических наук в Гарвардском университете Браун работал некоторое время в научно-исследовательском биологическом центре на Бермудских островах. Там он впервые непосредственно наблюдал два совершенно удивительных примера биологических ритмов: появление с точной месячной периодичностью стай бермудской креветки и скоплений атлантического светящегося червя. Самым замечательным в этих явлениях была их приуроченность к определенным фазам Луны. Таким образом, сама природа этих ритмов существенно отличалась от суточных или околосуточных ритмов, которые владели мыслями большинства исследователей.

После пребывания на Бермудских островах Браун еще несколько лет занимался изучением эндокринной системы ракообразных, но мысли о загадочности биологических ритмов не оставляли его. В конце концов он целиком переключился на исследование зависимости биологических ритмов от периодических изменений геофизических параметров.

Целью самого первого из поставленных им экспериментов было выявление зависимости ритмов у животных от температуры. Результаты аналогичных исследований Дж. Уэлша из Гарвардского университета и О. Парка из Университета штата Иллинойс вызывали у Брауна большие сомнения. По данным этих исследователей, свойственные организмам (различным ракообразным и насекомым) ритмы сохраняются при