воду на несколько часов и оставьте их прорастать на блюдце в течение 4–5 дней, каждый день подливая немного воды. Проростки отделите, промойте водой e тщательно разотрите деревянным пестиком или ложкой. Кашицу разбавьте двойным количеством дистиллированной воды и отожмите через плотную ткань в стакан. Такой экстракт содержит два фермента: альфа-амилазу и бета-амилазу. Дополнительной обработкой можно разрушить один из них, чтобы наблюдать действие другого. Альфа-амилазу разрушим нагреванием. К одной части экстракта из ячменя добавьте три части воды, размешайте смесь и нагревайте ее 20 мин на водяной бане при 70 °C, тщательно перемешивая. Охлажденный раствор содержит бета- амилазу.
Теперь, чтобы получить раствор альфа-амилазы, нужно разрушить бета-амилазу кислотой. Около 5 мл экстракта охладите до 2–3 °C в холодильнике или на льду, прибавьте неполную чайную ложку охлажденного уксуса и долейте в пробирку почти доверху холодную воду. Смесь перемешайте и оставьте на 15–20 мин, а затем нейтрализуйте раствор, добавляя порошок мела до прекращения выделения пузырьков. Еще раз размешайте смесь, разбавьте в два раза водой, дайте отстояться и слейте жидкость над осадком в чистую пробирку. На этом подготовка к опыту закончена.
В десять пробирок налейте по 1 мл раствора крахмала и по 9 мл воды. В пробирки 1–5 добавьте пипеткой десять капель раствора альфа-амилазы, в остальные пробирки — столько же раствора бета- амилазы, Содержимое всех пробирок перемешайте. Через 3 мин в пробирки 1 и 6 прибавьте одну каплю раствора иода и размешайте. То же проделайте с пробирками 2 и 7 через 5 мин, 3 и 8—через 10 мин, 4 и 9 —через 20 мин, 5 и 10—через 30 мин.
Вы заметите, что в присутствии альфа-амилазы окраска быстро меняется: синяя — фиолетовая— розовая — желтая: при этом образуются декстрины— осколки молекул крахмала. Бета-амилаза действует иначе: она как бы «откусывает» кусочки от молекул крахмала, и поэтому окраска с иодом остается синей, но по мере распада крахмала ее яркость уменьшается.
Результаты этого опыта наглядно показывают разнообразие свойств даже у похожих ферментов. В живых организмах ферменты обычно действуют совместно. Происходящие при этом превращения намного сложнее тех сравнительно простых реакций, которые вы наблюдали в пробирках. Но познание простого — это первый шаг к познанию сложного.
И НЕ ТОЛЬКО АМИЛАЗА
Вы уже убедились в том, что слюна — превосходный объект для биохимического исследования, и притом, в отличие от большинства других объектов животного происхождения, постоянно доступный.
Помимо амилазы, в слюне есть и другие ферменты, помогающие переваривать пищу, расщепляя сложные природные вещества на более простые. Но выделять и изучать их гораздо труднее, чем амилазу. Поэтому последние наши биохимические опыты мы поставим с веществами иной природы.
Ополоснув рот водой, соберите около 1 мл слюны в пробирку или флакончик и разведите тройным количеством дистиллированной или кипяченой воды. Отлейте половину содержимого в другую пробирку и капните примерно десять капель раствора ляписа — нитрата серебра AgNO3 (можно растворить в 1 мл воды половину ляписного карандаша из аптеки; примеси не помешают опыту). К белому осадку, выпавшему в пробирке, добавьте уксус, и осадок частично растворится. Так при взаимодействии с нитратом серебра ведут себя соли соляной (хлороводородной) и фосфорной кислот — хлориды и фосфаты.
Вторую часть раствора слюны слегка подкислите слабым раствором соляной кислоты и добавьте несколько капель 3 %-ного раствора хлорида железа FeCl3. Красно-бурая окраска свидетельствует о том, что в растворе есть роданиды — соли роданистоводородной кислоты. В то время как в слюне у курильщиков мало амилазы, роданидов, напротив, больше обычного. Это можно проверить экспериментально, если у вас есть курящие родственники.
Следующий опыт потребует примерно 5 мл слюны. Поместите ее в стакан и при перемешивании стеклянной палочкой добавьте несколько капель уксусной кислоты (не разбавленного уксуса, а эссенции). На палочку будет налипать белый комочек, похожий на сваренный яичный белок. Это вещество — муцин, он увеличивает вязкость слюны, загущает ее и способствует образованию пены.
Попробуем самостоятельно разобраться в составе муцина. Часть полученного вещества поместите в маленькую пробирку, капните немного, буквально 2–3 капли азотной кислоты и дождитесь, пока муцин пожелтеет. Теперь капните столько же концентрированного раствора щелочи (можно взять раствор аммиака) — и цвет станет оранжевым. Такая реакция называется ксантопротеиновой, она характерца для белков. Вместо нее можно провести биуретовую реакцию, описанную в главе «Опыты с белком», — и в том и в другом случае подтвердится белковая природа вещества.
Но это еще не все. Остальной муцин, выделенный из слюны, подвергните пробе на углеводы. Для этого воспользуйтесь цветной реакцией Молиша, описанной в главе «Опыты с углеводами», или, если у вас есть немного L-нафтола, то ее упрощенной модификацией: к раствору муцина в слабой, примерно 1 %-ной соляной кислоте добавьте три-четыре капли 0,1 %-ного раствора нафтола в спирте и после размешивания очень аккуратно капните на поверхность концентрированной серной кислоты. Фиолетовое кольцо будет свидетельствовать о том, что вы взяли для анализа углевод.
Выходит, что муцин — и белок, и углевод одновременно? Именно так. Он из класса глюкопротеинов, т. е. соединений, содержащих и белковую, и углеводную часть. Если разлагать его сильными кислотами, то образуются аминокислоты, из которых состоят белки, и одновременно — углеводы.
ХРОМАТОГРАФИЯ НА ДОМУ
Для разделения всевозможных смесей, для анализа и выделения из смесей отдельных веществ в лабораториях очень часто пользуются хроматографией: это один из лучших методов разделения и анализа смесей. Хроматографию применяют и в промышленности, когда надо очистить и разделить похожие вещества — органические и неорганические, от лантаноидов до аминокислот. Суть ее в том, что отдельные компоненты смеси (жидкости или газа) по-разному удерживаются веществом-адсорбентом, способным избирательно поглощать те или иные химические соединения.
Современные газовые и жидкостные хроматографы — сложные приборы с автоматическим управлением, нередко — с микро-ЭВМ, которая планирует ход исследования и выдает готовые результаты. Конечно, такое недоступно ни для домашней лаборатории, ни для кружка. Однако начинался этот способ анализа с простых приемов, которые доступны и начинающему химику.
Начнем с бумажной хроматографии. Химики-аналитики пользуются специальной хроматографической бумагой, но для наших опытов подойдет обычная фильтровальная бумага, а то и промокашка. Возьмите квадратный листок бумаги и в середину капните исследуемый раствор, содержащий смесь окрашенных веществ. Это может быть спиртовая настойка какого-либо лекарства, например валерианы или календулы. или приготовленный вами экстракт хлорофилла (см. главу «Экстракция»), или смесь красителей, составленная специально для этого опыта. На бумаге образуется пятно. В центр его капните несколько капель растворителя: в приведенных выше примерах растворителем должен служить спирт, причем одеколоном его заменить нельзя — в нем содержатся вещества, которые могут исказить ход опыта. Вместо этилового спирта можно взять изопропиловый — под названием ИПС его продают в хозяйственных магазинах как средство для мытья окон.
Итак, вы капнули несколько капель растворителя, и он, словно по фитилю, продвигаясь между бумажных волокон, разносит окрашенные вещества от пятна во все стороны. В зависимости от природы вещества и его молекулярной массы опыт идет быстрее или медленнее, но рано или поздно на листе оказывается несколько колец разного цвета. Сколько именно колец — зависит от того, сколько веществ было в анализируемой смеси.
В опыте с хлорофиллом таких колец будет два: желтое и серое.
