белка осаждаются, или седиментируют. Молекулярный вес белковых молекул можно определить по скорости их оседания. Так, молекула средней величины, например молекула гемоглобина (пигмент крови), имеет молекулярный вес, равный 67 600. Эта величина в 3700 раз превышает молекулярный вес воды, равный 18. Другие белковые молекулы еще крупнее, их молекулярный вес выражается сотнями тысяч единиц.
Размер и сложность белковой молекулы определяют размещение на ее поверхности атомов, способных нести электрические заряды. При этом каждому белку свойственно оригинальное расположение положительных и отрицательных зарядов, способное определенным образом изменяться в зависимости от изменения кислотности окружающей среды.
Если раствор белка поместить в электрическое поле, отдельные белковые молекулы начинают двигаться либо к положительному, либо к отрицательному электроду со скоростью, обусловленной характером электрического заряда, размером и формой молекулы и т. д. Нет двух белков, которые в любых равных условиях обладали бы одинаковой скоростью. На основе этой закономерности шведский химик Арне Вильгельм Каурин Тизелиус (род. в 1902 г.), ученик Сведберга, в 1937 г. сконструировал прибор, который состоял из U-образной трубки с белковой смесью, способной перемещаться под действием электрического поля. (Это явление перемещения в электрическом поле взвешенных в жидкости частиц называется электрофорезом.) Ввиду того что каждый компонент смеси движется со свойственной ему скоростью, смесь можно постепенно разделить. U-образная трубка собирается из особым образом соединенных секций, ее легко расчленить. Благодаря этому каждую составную часть смеси, находящуюся в отдельной секции, можно отделить от остальных компонентов.
Применяя соответствующие цилиндрические линзы и используя изменение отражения светового луча при прохождении его через суспендированную смесь (по мере изменения концентрации белков), стало возможным проследить процесс разделения смеси. Изменение рефракции давало на фотографии волнообразные кривые, по которым можно было вычислить количество каждого белка в смеси. В частности, белки плазмы крови, подвергнутые электрофорезу, были разделены на множество фракций, включая альбумин и три группы глобулинов — α, β и γ, — причем фракция γ-глобулинов содержала антитела.
В 40-е годы были разработаны методы промышленного получения различных белковых фракций.
Ультрацентрифугирование и электрофорез зависели от общих свойств молекулы белка. Применение рентгеновских лучей позволило биохимикам исследовать внутреннее строение молекулы. Проходя через вещество, пучок рентгеновских лучей рассеивается. Если частицы вещества расположены в строгом порядке (как атомы в кристалле), то рассеяние лучей будет также упорядочено. Пучок рентгеновских лучей, попадая на фотопленку после рассеяния кристаллом, даст симметричное расположение точек. На основании такого рисунка можно определить положение атомов в кристалле.
Крупные молекулы нередко состоят из более мелких единиц, равномерно расположенных внутри молекулы. Это справедливо и для белковых молекул, структурными единицами которых являются аминокислоты. О расположении аминокислот в молекуле белка можно судить по тому, как рассеивается пучок рентгеновских лучей. Хотя рассеяние луча белками выражено не столь ярко, как рассеяние кристаллами, его все же можно использовать для анализа белков. Общая картина пространственного расположения аминокислотных единиц была выявлена в начале 30-х годов. Выдающиеся исследования американского химика Лайнуса Полинга (род. в 1901 г.) выявили точное распределение аминокислот и показали, что их цепь представляет собой улиткообразную спираль.
По мере того как ученые все глубже проникали в строение белка, они получали все более сложные результаты рентгеноструктурного анализа. Появилась необходимость в сложных и трудоемких математических вычислениях, которые были не под силу человеческому разуму. К счастью, в 50-х годах была создана электронно-вычислительная машина, способная в кратчайший срок выполнять длиннейшие ряды вычислений.
Впервые электронно-вычислительную машину применили для изучения витаминов. Еще в 1926 г. два американских врача, Джордж Ричард Майнот (1885–1950) и Уильям Перри Мерфи (род. в 1892 г.), заметили, что регулярное введение печени в диету больных так называемым злокачественным малокровием спасает их от, казалось бы, неминуемой смерти. Они предположили, что это свойство печени обусловлено присутствием витамина. Этот витамин, получивший название В12, удалось выделить только в 1948 г. Его молекула оказалась очень сложной; она состоит из 183 атомов шести различных элементов. В 1956 г., используя новые физические методы и вычислительную аппаратуру, группа ученых под руководством шотландского химика-органика Александра Тодда (род. в 1907 г.) выяснила детальное строение этого витамина. Поскольку среди прочих структур он содержал циангруппу, атом кобальта и аминогруппу, витамин получил название цианокобаламина.
Неизбежность применения электронно-вычислительных машин при дифракционном изучении белков стала очевидной. В 1960 г., используя метод дифракции рентгеновских лучей и вычислительные машины, английские биохимики Макс Фердинанд Перутц (род. в 1914 г.) и Джон Каудери Кэндрю (род. в 1917 г.) смогли дать полную картину строения молекулы миоглобина (мышечного белка, в какой-то степени напоминающего гемоглобин, но в четыре раза более мелкого) с точным указанием расположения каждой аминокислоты.
Метод хроматографии
Выяснить строение крупных молекул посредством метода дифракции рентгеновских лучей значительно легче, если известны химическая природа субъединиц молекул и хотя бы в общем виде их расположение.
Прогресс в изучении химии белка был достигнут не сразу. Ученые минувшего столетия могли только весьма голословно утверждать, что белковая молекула состоит из аминокислот. На рубеже XX в. немецкому химику Эмилю Герману Фишеру (1852–1919) удалось показать, каким образом аминокислоты комбинируются в молекуле белка. В 1907 г. он даже получил очень простое белковоподобное соединение, состоящее из 18 единиц: 15 молекул одной аминокислоты и 3 молекулы другой.
Какова же структура более сложной белковой молекулы, встречающейся в природе? И в первую очередь, каково точное число каждого типа аминокислот в молекуле белка? Проще всего ответить на этот вопрос, расщепив белковую молекулу на отдельные аминокислоты и на основании химического анализа определив относительное количество каждого компонента.
Однако для современников Фишера этот путь был неприемлем. В те времена обычными химическими методами нельзя было различить аминокислоты, обладавшие сходным строением. Ответ на этот вопрос пришел с появлением нового метода, принцип которого в 1903 г. впервые разработал русский ботаник Михаил Семенович Цвет (1872–1919). Исследуя пигменты растений, Цвет получил сложную смесь, состоящую из столь сходных компонентов, что разделить ее существовавшими химическими методами было почти невозможно. Тогда ученый пропустил раствор смеси по каплям через стеклянную трубку (колонку), заполненную порошком окиси алюминия. Поверхность частиц порошка с разной силой удерживала различные вещества смеси. Когда смесь смывали свежим растворителем, вещества разделялись. Компоненты, наименее прочно связанные с поверхностью порошка, смывались в первую очередь. В конце концов смесь оказывалась разделенной на отдельные пигменты, каждый из которых характеризовался определенной полосой цвета в спектре. Этот метод разделения по цвету получил название хроматографии (от греческих слов chrömatos — окраска, цвет и graphein — записывать). К сожалению, работы Цвета прошли незамеченными. Только через полтора десятилетия Вильштеттер, вновь применив метод Цвета, добился его признания. Хроматографию стали широко применять для разделения сложных смесей.
Однако пользоваться колонкой из порошка окиси алюминия для разделения ничтожных количеств смеси было чрезвычайно сложно. Требовался более простой и надежный метод.
Выход был найден лишь в 1944 г., когда английские биохимики Арчер Джон Портер Мартин (род. в 1910 г.) и Ричард Лоуренс Миллингтон Синдж (род. в 1914 г.) использовали для метода хроматографии простую фильтровальную бумагу. Опыты проводили так. Каплю смеси аминокислот просушивали близ
