Растворимость в воде. Микрокапсулы выдерживали в течение 2 ч в очищенной воде и вели наблюдения за состоянием оболочки и ядра.
Оценка массовой доли влаги. Массовую долю влаги определяли по стандартной методике ОФС 42-0087–08 «Потеря в массе при высушивании». Для этого капсулы растирали и размещали на фильтровальной бумаге. Образцы в фильтровальной бумаге помещают в сушильный шкаф и высушивают при 100–110 °С в течение 1 ч, охлаждают около 20 мин в эксикаторе и взвешивают. Массовая доля высчитывалась по разнице в весе, переведённой в проценты.
Получение бактериального концентрата бифидобактерий
для изучения влияния резистентного крахмала в сочетании
с альгинатом на формирование микрокапсул
Способ получения бактериального концентрата бифидобактерий не ниже 109 КОЕ/мл в жидкой форме предусматривает приготовление питательной среды для культивирования бифидобактерий. В приготовленную питательную среду вносят сублимированную культуру штамма Bifidobacterium animalis АС-1540 и культивируют при температуре 37–38 °С до получения микробной массы с содержанием бифидобактерий не менее 108 КОЕ/мл. Далее производят второй пассаж, который предусматривает внесение 10 % выращенной культуры штамма Bifidobacterium animalis АС-1 540 в среду культивирования и накопления при температуре 37–38 °С. Третий пассаж предусматривает внесение 10 % выращенной культуры штамма Bifidobacterium animalis АС-1540 в среду культивирования и накопления при температуре 37–38 °С в течение 6 ч. Далее производят центрифугирование при температуре 4 °С в течение 20 мин при 5000 об/мин. Получают бактериальный концентрат, содержащий не менее 1010 КОЕ/мл, который используют для получения микрокапсул.
Получение микрокапсул с использование резистентного крахмала и альгината натрия
Микрочастицы были получены в соответствии с технологией экструзии. Для этого аэрограф (размер сопла 0,3 мм, модель EW 110) соединялся с воздушным компрессором (модель Jas-1203) с давлением воздуха 2,55 кгс/см 2 и высотой 30 см между распыляющим соплом и CaCl2. Были приготовлены два раствора, содержащие 1% альгината натрия, первый из которых содержит только альгинат натрия, а последний содержит альгинат натрия + 1% пребиотического Hi-maize. После полной дисперсии полимеров добавляли Bifidobacterium animalis АС-1540, штаммы и растворы распыляли в 0,1 М CaCl2.
Частицы перемешивали в течение 30 мин в растворе CaCl2 для обеспечения полного гелеобразования и затем удаляли из раствора с использованием стерилизованного сита (50 мкм), промывая стерильной дистиллированной водой на аналитическом сите, размер ячейки 500 мкм, нерж. Влажные микрочастицы хранились в стерильных флаконах с крышками (влажные микрочастицы альгината натрия, влажные микрочастицы альгината натрия + Hi-maize), а оставшаяся часть лиофилизировалась лиофильным лиофилизатором (модель L101) до 24 ч и впоследствии хранилась в стерильных флаконах с крышками (высушенные вымораживанием микрочастицы альгината натрия, высушенные вымораживанием микрочастицы альгината натрия + Hi-maize).
После приготовления растворов их подвергали фильтрации для удаления нерастворённых компонентов и примесей. Далее лиофилизированные бифидобактерии (содержащие в 1 г культуры 1011 живых клеток, с массовой долей влаги 5,4±0,32 %) направляли на процесс диспергирования при температуре плюс 4±2оС с нетоксичной суспензией полимера в соотношении 1,0:12,0 по общей массе. Далее осуществляли осаждение образованных микрокапсул и фильтрование. После фильтрования микрокапсулы направляли на промывание и сушку.
Исследование микроструктуры микрокапсул. Общую морфологию микрокапсул определяли с помощью сканирующего электронного микроскопа (SEM) (JEOL-JSM-5410LV, Япония). Микрокапсулы помещались на подложку столика микроскопа с помощью двухсторонней ленты, покрытой золотым напылением. Ускоряющее направление микроскопа – 5 кВ, ток зонда – 6-Ю-6 А. Диаметры микрокапсул определяли с помощью программного обеспечения ImageJ (NIH, США). Средний диаметр определялся путём измерения 100 микрокапсул.
При анализе количества жизнеспособных клеток исследуемых микроорганизмов осуществляли растворение микрокапсул, затем проводили высев на стерильную полужидкую среду для культивирования и выделения бифидобактерий.
Определение специфической активности капсулированных пробиотиков проводили согласно МР 1.2.2566-09 «Оценка безопасности наноматериалов in vitro и в модельных системах in vivo», ОФС.1.2.1.0005.15 «Растворимость».
Питательные среды и опытные растворы для определения специфической активности капсулированных пробиотиков приготовлены и стерилизованы в лаборатории «Питательных сред» ФБУН МНИИЭМ им. Г. Н. Габричевского Роспотребнадзора.
3. ПРАКТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ И ОСОБЕННОСТИ
МИКРОКАПСУЛИРОВАНИЯ ПРОБИОТИЧЕСКИХ КУЛЬТУР
3.1. Способы получения иммобилизованных
пробиотических культур. Сравнительный анализ качественных
характеристик микрокапсул и способов их получения
Микрокапсулирование – это процесс, при котором один материал или смесь материалов покрываются или захватываются другим материалом или системой. Материал с покрытием называется активным или основным материалом и может быть твёрдым, жидким или газообразным, а материал покрытия называется оболочкой, материалом стенки, носителем или инкапсулирующим агентом. Микрочастицы состоят из многокомпонентной структуры диаметром 1–1000 мкм [67]. Обычно микросферы описываются как матричная система, в которой активный ингредиент диспергируется/растворяется в матрице носителя. Микрокапсулы имеют, по меньшей мере, один дискретный домен активного агента, а иногда и больше (система резервуаров) [91]. В результате микрокапсула состоит из слоя инкапсулирующего агента, который изолирует и защищает активное вещество, избавляя его от неадекватного воздействия. Микрокапсулы могут иметь правильную (например, сферическую, трубчатую и овальную) или неправильную форму [54].
В настоящее время микрокапсуляция имеет многочисленные применения в различных областях промышленности, таких как продукты питания [85], текстильные [36], фармацевтические [105, 23], косметические [40] и агрохимические [92] отрасли. Этот метод позволяет улучшить и/или модифицировать характеристики и свойства активного материала, а также его защиту, стабилизацию и медленное высвобождение.
Микрокапсуляция может изменять цвет, форму, объем, чувствительность к давлению, чувствительность к теплу и светочувствительность инкапсулированного вещества [76]. Кроме того, она может защитить основное вещество от воздействия ультрафиолетовых лучей, влаги и кислорода; увеличить срок хранения летучего соединения; снизить скорости испарения или переноса активного материала из ядра в среду; предотвратить химическую реакцию; уменьшить проблемы агломерации тонкоизмельчённых порошков; улучшить обрабатывающие свойства липких материалов; контролировать процесс высвобождения веществ; уменьшить токсичность или раздражение [81].
В настоящее время существует множество методов микрокапсулирования, и это число продолжает увеличиваться по мере того, как компании продают продукцию по запатентованным и инновационным технологиям микрокапсулирования [45, 129]. Многочисленные методы позволяют инкапсулировать активный материал в зависимости от типа материала, который должен быть инкапсулирован, характеристик высвобождения инкапсулированного соединения, применения и регулятивных соображений. Он может влиять на конечные характеристики и свойства микрочастиц [60]. Несмотря на то, что для микрокапсулирования был представлен ряд методов, их можно разделить на три основные категории: (I) химические процессы (например, межфазные и in situ методы полимеризации); (II) физико-химические процессы (например, коацервация (разделение фаз) и испарение); (III) физико-механические процессы (например, метод воздушной суспензии, распылительная сушка, распыление, охлаждение распылением и покрытие с псевдоожиженным слоем). Ниже приводятся некоторые из наиболее важных и обычных методов микрокапсулирования.
В таблице 3.1 приведены способы микрокапсулирования, представляющие размер частиц. Данные, представленные в таблице, характеризуют эффективность процессов инкапсуляции. Комплексная и простая коацервации являются наиболее эффективными методами, но одновременно дорогостоящими. Далее по эффективности можно выделить распылительную сушку и экструзию. Спрей-охлаждение и молекулярное включение являются наименее эффективными способами инкапсулирования.
Таблица
