Стабилизация внешней ситуации и политико-экономическое укрепление Великого княжества Литовского позволяли в некоторых случаях не считаться с отдельными положениями акта Люблинской унии. В частности, проводились отдельные сеймы, а в период так называемого бескоролевья (1574–1576) на сейме в Вильно обсуждался вопрос об избрании короля. В 1580 году на сейме Великого княжества присутствовал король речи Посполитой Стефан Баторий. Все это свидетельствует, что Польша вынуждена были считаться с интересами Великого княжества Литовского. Однако на практике Польша, которая была более сильной в экономическом и политическом отношениях, получила большие возможности осуществлять великодержавную политику в отношении населения Великого княжества.
Усилия Речи Посполитой на территории Беларуси направлялись на насаждение католицизма и дальнейшую полонизацию. Противодействовать этим явлениям законодательно было трудно. Сенат Речи Посполитой состоял преимущественно из польских представителей. Такая же ситуация была и в сейме. Там из 180 послов только 46 приходилось на Великое княжество Литовское, Русское и Жемайтское. В насаждении католицизма был заинтересован и Ватикан, который давно стремился включить в сферу своего влияния православное население.
Причиной активизации деятельности католической церкви было также возникновение и развитие реформационного движения в Великом княжестве. Во второй половине XVI века быстро распространялись идеи западноевропейского протестантизма и других религиозных течений. Особенно увлекались релизиозными новшествами такие магнаты, как Сапеги, Радзивиллы, Глебовичи, Валовичи и др., которые были противниками унии с Польшей. С помощью протестантской веры они старались сохранить обособленность Великого княжества и ослабить в нем влияние католической Польши. Некоторые слои шляхты и знати Реформация привлекала возможностью подорвать могущество католической церкви, которая ущемляла их права.
Наибольшее распространение в Великом княжестве Литовском получил кальвинизм. В него перешла значительная часть магнатов и шляхты. На территории Беларуси (в Витебске, Бресте, Новогрудке, Ивье, Слуцке и некоторых других городах) действовали десятки реформационных общин, а при них — церкви, школы, приюты, типографии. Реформационное движение содействовало активизации духовной жизни общества, расширению международных контактов, книгопечатанию и т. д. Кальвинизм сначала объединил все слои, принимавшие участие в реформации, но затем из него выделилось арианское и некоторые другие течения, предводители которых требовали социальных преобразований. Кальвинисты магнаты и шляхта были недовольны этими призывами, прекратили поддерживать реформаторов и перешли в католицизм, что предопределило во второй половине XVII века упадок реформационного движения.
Для упрочения католицизма на следующий год после Люблинской унии в Великом княжестве Литовском появились опытные миссионеры ордена иезуитов во главе с главным идеологом контреформации П. Скаргой. Иезуиты взяли в свои руки образование, занялись благотворительной деятельностью, открыли сеть костелов и монастырей, что принесло свои плоды. Католицизм начал вытеснять протестантские общины, процесс окатоличивания приобрел массовый характер, но встретил массовое сопротивление православного населения и православной церкви.
Поняв, что превратить православных в католиков прямым путем не удастся, Ватикан и правящие круги Речи Посполитой выработали план, по которому объединение католической и православной церкви, якобы в целях преодоления раскола между христианскими церквями, происшедшим еще в 1054 году, должно было произойти под руководством Ватикана. Этот план был поддержан иерархами православной церкви. Началась подготовка к объединению — унии. В июне 1590 года православные епископы, руководствуясь материальными расчетами, подписали грамоту, в которой дали свое согласие на заключение унии. Добившись согласия руководства православной церкви, иезуиты и другие монашеские ордена начали усиленно пропагандировать идеи, в которых обосновывалась необходимость унии.
В эту кампанию включилась и королевская администрация. Всем тем, кто примет унию, король обещал льготы и привилегии. В Великом княжестве Литовском идеи унии были восприняты неоднозначно. Феодалы, добивающиеся новых привилегий и земель, унию поддержали. Те, кто понимал подлинный смысл и цели унии, а также результаты, к которым она приведет, отнеслись к ней с подозрением. Активно выступили против унии православные братства и широкие слои населения. Но верхушка православной церкви в 1591 году в Бресте еще раз дала понять, что унию принять готова.
Осенью 1595 года король Речи Посполитой Сигизмунд III издал универсал, согласно которому православная церковь в Речи Посполитой объявлялась объединенной с католическим костелом. Для закрепления унии римский папа издал об унии специальную буллу. В октябре 1596 года представителями иерархии католической и православной церквей, несмотря на очень серьезные разногласия между ними, уния была подписана.
Суть унии заключалась в том, что объединенная церковь создавала промежуточную — униатскую церковь, в которой все обряды, праздники и т. д. должны оставаться такими, как в православной, чтобы