Для иммобилизации микроорганизмов пробиотиков используется три метода:
– адсорбция;
– включение в структуру геля;
– микрокапсулирование.
Наиболее предпочтительным для фиксации живых клеток микроорганизмов является создание такой системы, в которой адсорбционная иммобилизация сочетается с пространственной и создаются наиболее оптимальные условия для биоагента. Поэтому для иммобилизации консорциума бифидобактерий необходим метод, который обеспечил бы защиту микроорганизмов от воды – фактора, который способствует прорастанию спор, и кислорода – фактора, обладающего губительным по отношению к анаэробам действием.
При создании функциональных продуктов, обогащённых пробиотиками, во многих случаях предпочтение отдаётся микрокапсулированию, так как этот метод позволяет повысить устойчивость клеток микроорганизмов к низкой рН среды, ферментам и желчи, антибактериальным препаратам, бактериофагам, к замораживанию и лиофилизации в процессе производства, а также к кислороду. Преимуществом микрокапсулированных форм пробиотиков является также возможность обеспечения равномерного дозирования, что достигается, в том числе, и включением в капсулы.
Так как суть микрокапсулирования заключается в создании своеобразной оболочки вокруг клетки микроорганизма, то важным этапом является подбор для этого подходящего материала. От его свойств зависит эффективность защиты микроорганизмов от негативных факторов окружающей среды, а также способность к высвобождению в нижних отделах ЖКТ. При выборе носителя в рамках нужд промышленного производства учитываются следующие требования: отсутствие токсичности, доступность, невысокая стоимость.
При разработке иммобилизованных форм биологических препаратов важнейшим моментом является выбор сорбента-носителя. Согласно классификации сорбентов по химической структуре выделяют: активированные угли (углеродные адсорбенты); силикагели; цеолиты; алюмосиликаты; алюмогели; пищевые волокна и сорбенты (комбинированные и/или органоминеральные). Можно выделить минеральные (цеолиты, алюмосиликаты) и органические сорбенты (растительные волокна), сорбенты природного происхождения (хитозан, пектин, перлит, диатомит, кокосовое волокно и др.) и искусственно синтезированные, например СУМС-1 (сферический углеродно-минеральный сорбент), Сфероцелл. Для заключения пробиотических препаратов в современные энтеросорбенты необходимо соблюдение следующих условий, а именно применяемые вещества:
1) должны быть нетоксичными (в процессе метаболизма в живом организме применяемые вещества не должны образовывать соединения, оказывающее прямое или опосредованное токсическое воздействие на системы живого организма);
2) не должны оказывать травматического действия на слизистые оболочки живого организма;
3) не должны обладать обратным эффектом (усиливать диспептические нарушения);
4) должны обладать высокой сорбционной `мкостью;
5) должны обладать высокими органолептическими свойствами (удобная фармацевтическая форма);
6) не должны изменять (негативно воздействовать) на работу органов желудочно-кишечного тракта.
Как показал анализ данных литературы, наиболее часто для микрокапсулирования пробиотиков в пищевой промышленности используются: альгинат натрия и пектин, хитозан, каррагинан, желатин, ксантан-желатиновая смесь, ацетилфталат целлюлозы и др. Применение для процесса микрокапсулирования вышеперечисленных веществ позволяет вести процесс иммобилизации в более щадящих условиях, тем самым сохраняя биологические свойства веществ и целостность клеток.
Наиболее удовлетворяют всем медицинским требованиям следующие группы: различные виды активированных углей, углеродоминеральные сорбенты, пищевые волокна, цеолиты. Однако для технологии микрокапсулирования с целью иммобилизации пробиотических бактерий наиболее успешно применяются гели на основе альгината кальция, альгината натрия, каппа-каррагинана, желатина, хитозана, агарозы и другие растительные и животные волокна. На основании показателей безопасности, стоимости и технологичности для проведения исследований с целью получения микрокапсул с включёнными бифидобактериями были выбраны типы носителей, представленные ниже.
Каррагинан, или карраген, представляет собой линейный сульфатный полисахарид. Карраген получают из красных морских водорослей Chondrus crispus, произрастающих у берегов Ирландии, линейный полисахарид.
Природный гелеобразователь – каррагинан – получают методом экстракции из красных морских водорослей с последующей многостадийной обработкой (очисткой). Применяется в пищевой промышленности как в рафинированном, так и нерафинированном виде. Формулы различных видов каррагинанов представлены на рисунке 3.2.
Молекулы каррагена представляют собой большие гибкие структуры, обладающие способностью формировать гели при комнатной температуре. Это свойство каррагена обусловливает его применение в пищевой промышленности. Гели ведут себя как псевдопластик. Каррагинаны отличаются по степени полимеризации:
– выделяемые из Kappaphycus cottonii, способные образовывать сильные гели, называются каппа;
– выделяемые из водоросли Gigartina, способные образовывать гели с белками, называются йота. Данный вид каррагинана применяют в молочной промышленности.
Рисунок 3.2 – Формулы разновидностей каррагинанов
Наиболее важным различием, влияющим на свойства классов каррагинанов, является количество и положение cульфатных эфиров на повторяющихся субъединицах галактозы. Большее количество сульфатных эфиров понижает температуру растворения каррагинана и приводит к более мягким гелям или препятствует образованию гелей (лямбда-каррагинан).
Многие красные водоросли производят различные типы каррагинана на разных стадиях развития. Например, род Gigartina производит главным образом каппа-каррагинаны в стадии гаметофита и лямбда-каррагинаны в стадии спорофита.
Только классы лямбда и натриевые соли других классов растворимы в холодной воде, в то время как в горячей растворяются все классы каррагинана.
Применять каррагинан начали в VII веке до н. э. в Китае, однако получение каррагинана в больших объёмах для использования в промышленности отмечается с 30-х годов XX века.
Филиппины на сегодняшний день являются основными производителями каррагинана, где для этих целей специально выращиваются морские водоросли видов Eucheuma denticulatum, Kappaphycus alvarezii и Kappaphycus striatum, которые растут вглубь моря на 1,5–2 м. В основном для выращивания водорослей используют нейлоновые тросы, фиксированные на бамбуковых опорах. Когда масса водорослей достигает одного килограмма (спустя примерно три месяца), их собирают, сушат, упаковывают и отправляют на предприятия.
На предприятии водоросли измельчают, удаляют посторонние примеси и промывают. Для удаления из водорослей, промытых нагретым щелочным раствором, целлюлозы проводят центрифугирование и фильтрацию. Полученный раствор каррагинана концентрируют выпариванием, сушат и измельчают.
Пектин (пектиновые вещества) представляет собой разветвлённый полисахарид, состоящий в основном из полимеров галактуроновой кислоты, рамнозы, арабинозы и галактозы. Процент d-галактуроновой кислоты, этерифицированной метанолом, указывает на степень этерификации. Повторяющийся сегмент молекулы пектина имеет некоторые функциональные группы, включая карбоксил, сложный эфир и амидные группы. Кроме того, в структуре пектина присутствует высокая доступность вторичных гидроксильных групп. В литературе было указано, что пектины, которые имеют низкую степень этерификации, обладают превосходной способностью образовывать гели через взаимодействие с двухвалентными катионами.
Пектин присутствует в растворимой или нерастворимой форме во всех наземных растениях и в ряде водорослей. Особенно много пектиновых веществ во фруктах, ягодах, стеблях (лён), корнеплодах.
Пектины – структурные элементы растительных тканей, обеспечивающие поддержание напряжённого состояния клеток, устойчивость в процессе хранения, а также повышение засухоустойчивости.
Пектин является гелеобразователем, загустителем, стабилизатором, осветлителем, влагоудерживающим агентом, веществом, облегчающим фильтрование и средством для капсулирования, зарегистрирован
