научные и практические аспекты микрокапсулирования пробиотических культур

три дозы: 1:5 – 2·10⁷ КОЕ/мл; 1:10 – 1·10⁷ КОЕ/мл; 1:15 – 6,7·10⁶ КОЕ/мл. Растворы препарата вводили каждой мыши перорально при помощи зонда по 1 мл. За 4 ч до манипуляций у животных отнималась вода и еда, кормление возобновлялось через 2 ч после проведения процедуры. В качестве контроля контрольной группе перорально вводили физиологический раствор С080812. Следует отметить, что контрольная группа была сформирована из пяти мышей и являлась контролем одновременно в экспериментах по определению безвредности, «острой токсичности» и «хронической токсичности», так как они проводились параллельно в один отрезок времени. Животные принадлежали одной партии.

Наблюдение за мышами осуществлялось в течение 7 суток. Время эксперимента составило 14 суток, все животные остались живы.

Во всех группах животные выглядели здоровыми, охотно поедали корм, были подвижны, шерстяной покров густой, белого цвета, плотно прилегал к поверхности тела. Область живота в объёме не увеличена. Частота мочеиспусканий и цвет мочи соответствовал физиологической норме. Окраска слизистых, характер стула в течение всего времени проведения опыта оставались без изменений. Зоосоциальное поведение не отличалось от контрольных животных. Результаты взвешивания животных приведены в таблице 3.14.

Таблица 3.14 – Клинические показатели животных 1, 2 и 3 групп

при определении безвредности и «острой токсичности» микрокапсул,

состоящих из природных биодеградируемых полимеров,

содержащих бифидобактерии

На 14-е сутки после введения препаратов проводили усыпление животных с помощью хлороформа с дальнейшими морфологическими исследованиями внутренних органов.

При макроскопическом исследовании отчётливого влияния препаратов на состояние внутренних органов мышей не установлено, различий между контрольными и опытными группами не обнаружено. Расположение внутренних органов правильное. Свободной жидкости в плевральной и брюшной полостях не обнаружено. Просвет трахеи и бронхов свободен, слизистая влажная, блестящая. Селезёнка не увеличена, вытянутой формы, плотной консистенции, поверхность гладкая. Печень правильной формы, не увеличена, плотной консистенции, однородна, без включений, гладкая и блестящая.

Таким образом, микрокапсулы, состоящие из природных биодеградируемых полимеров, содержащие бифидобактерии, являются безвредными для белых мышей SHK-линии обоих полов. При пероральном введении не была определена доза LD_50, так как клинических признаков отравлений при введённых дозах не наблюдалось (ограничение дозы обусловливалось возможностью введения концентрированного препарата через зонд).

 

Рисунок 3.25 – Форма колоний штамма Bifidobacterium bifidum 791,

имеющих покрытие микрокапсулы, выросшего в течение 48 ч в толще

полужидкой бифидум-среды после моделей желудка и кишечника

Рисунок 3.26 – Клетки штамма Bifidobacterium bifidum 791, покрытые микрокапсулой, выросшие после обработки в моделях желудка и кишечника

 

Рисунок 3.27 – Процессуальная технологическая схема производства

микрокапсул с активизированной культурой Bifidobacterium bifidum 791

Способ получения бактериального концентрата бифидобактерий не ниже 10⁹ в жидкой форме предусматривает приготовление питательной среды для культивирования бифидобактерий. В приготовленную питательную среду вносят от 1 до 5 доз сублимированной культуры штамма Bifidobacterium bifidum 791 и культивируют при температуре 37–38 °С до получения микробной массы с содержанием бифидобактерий не менее 10⁸ КОЕ/мл. Далее производят второй пассаж, который предусматривает внесение 10 % выращенной культуры штамма Bifidobacterium bifidum 791 в среду культивирования и накопления при температуре 37–38 °С. Третий пассаж предусматривает внесение 10 % выращенной культуры штамма Bifidobacterium bifidum 791 в среду культивирования и накопления при температуре 37–38 °С в течение 6 ч. Далее производят центрифугирование при температуре 4°С в течение 20 мин при 5000 об/мин. Полученный бактериальный концентрат содержит не менее 10¹⁰ КОЕ/мл и используется для получения микрокапсул.

С цель уточнения микроструктуры поверхности оболочки капсулы были проведены дополнительные исследования по определению микроструктуры поверхности микрочастиц. Снимки, полученные в результате применения сканирующего растрового электронного микроскопа, представлены на рисунке 3.28.

Рисунок 3.28 – Морфология и микроструктура высушенных микрочастиц

из альгината и вспомогательного природного полимера, полученные методом сканирующей электронной микроскопии

Для проведения исследования применялся сканирующий растровый электронный микроскоп (РЭМ) Tescan высокого разрешения серии MIRA. Анализ данных, полученных в результате проведённых исследований при помощи сканирующего растрового электронного микроскопа (РЭМ) Tescan, свидетельствует о том, что капсулы имеют конфигурацию, близкую к сферической форме без микротрещин и разрывов, что позволяет обеспечить достаточный уровень защиты бифидобактерий от воздействия агрессивных факторов желудочно-кишечного тракта. Характеристика размера частиц является важным исследованием при разработке способа и технологических параметров получения размеров микрочастиц в оптимальном диапазоне. Морфологические характеристики микрочастиц определялись при помощи оптической и сканирующей электронной микроскопии. Анализ размеров частиц выполняли также с применением сканирующей электронной микроскопии. Исследуемый образец перед проведением исследования был высушен, что привело к потере сферической формы микрокапсул.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

 

Разработан способ получения иммобилизованных пробиотических культур на основании анализа эффективности процессов микрокапсулирования. Получены микрокапсулы с заданными характеристиками, исследована возможность промышленного масштабирования и исключения негативного воздействия на бифидобактерии в процессе иммобилизации. Экструзионный способ для микрокапсулирования бифидобактерий позволил получить частицы размером от 150 до 2000 мкм, лёгкая техника масштабирования предполагает применение метода при промышленной реализации технологии.

Выполнен анализ сравнительных характеристик способа получения иммобилизованных пробиотических культур с аналогами. В результате применения простой коацервации образуются частицы размером 20–200 мкм с высокой герметизацией микрокапсул, при комплексной коацервации – частицы размером 5–200 мкм. Однако оба процесса являются весьма дорогостоящими. Применение распылительной сушки негативно сказывается на жизнеспособности инкапсулируемых бифидобактерий. Наиболее приемлемым способом для микрокапсулирования бифидобактерий является экструзия. Микрокапсулы характеризуются размером от 150 до 2000 мкм, лёгкая техника масштабирования предполагает промышленную реализацию и низкие технологические затраты.

Выполнена оценка ряда характеристик полученных микрокапсул. Исследованы морфологические характеристики микрочастиц с помощью оптической и сканирующей электронной микроскопии, показывающие, что влажные микрочастицы близки к сферическим, причём материал ядра распределяется по всей матрице. Как видно на оптических микрофотографиях, частицы альгината и микроорганизмы были обнаружены внутри микрочастицы. Полученные результаты подтверждают эффективность выбранного способа иммобилизации бифидобактерий и для их заключения в образовавшуюся структурированную матрицу полимера. Полученные микрочастицы единообразны и обладают сферической формой.

Подобраны носители для иммобилизации бифидобактерий: пектин, желатин, альгинат натрия, альгинат калия, каррагинан, хитозан.

Исследовано влияние применения резистентного крахмала на процесс иммобилизации бифидобактерий. Использование резистентного крахмала (Hi-maize) в сочетании с альгинатом оказывает синергическое действие на гелеобразование, обеспечивая дополнительную защиту пробиотических клеток.

Исследованы структурные изменения микрочастиц, вызванные процессом сублимационной сушки. Морфология высушенных вымораживанием микрочастиц, исследованных с помощью сканирующей электронной микроскопии, показала высокую агломерацию среди частиц и разнообразие распределения частиц по размерам. Проведена сравнительная оценка характеристик полученных микрокапсул. В процессе лиофилизации микрокапсулы подвергались воздействию низких температур, что приводило к образованию кристаллов льда и сублимации льда при пониженном давлении, в результате чего получали пористый сухой продукт. Микрочастицы, содержащие резистентный крахмал Hi-Maize, были более агломерированы по сравнению с микрочастицами альгината. В результате исследования лиофилизированные микрочастицы имели средний диаметр 150 и 97 мкм, соответственно микрочастицы альгината + резистентный крахмал (Hi-maize) микрочастиц с альгинатной матрицей. Структурные изменения, вызванные процессом сублимационной сушки, увеличивают размер пор, что позволяет быстро и